生物活性黏合涂层改善组织工程视网膜神经支
本文原载于《中华眼科杂志》年第4期
视网膜神经元损伤和修复是神经性视觉损伤发生、发展和转归共同的科学问题[1,2,3,4]。近年随着干细胞组织工程研究的发展，干细胞诱导为特定损伤靶组织细胞[5,6,7]联合医用高分子支架材料治疗受损的视神经细胞，成为再生医学领域研究的热点[8]。目前，国内外已有学者将胚胎干细胞及自身诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSC）诱导分化为视网膜神经节细胞（retinalganglioncell，RGC）[9,10]，并使用医用高分子材料模拟细胞外基质支持神经细胞分化生长[8,11]，但有关细胞神经支架活体内眼移植黏附视网膜组织的报道较少。种子细胞、支架材料与组织构建是组织工程研究的三大方向，复合材料的构建和优化是神经组织工程领域的研究核心之一[12,13]。本实验团队前期成功诱导了人iPSC源性RGC（国家发明专利号：CNA），并构建了聚乳酸-羟基乙酸共聚物可降解视网膜神经支架（国家发明专利号：CNA）[14]。本研究通过对组织工程视网膜神经支架进行黏性修饰，提高材料的组织黏附性，并检测改性后支架材料的细胞和组织相容性，以期为探索适于内眼组织移植的复合材料奠定基础。
材料及方法
一、材料
层黏连蛋白（美国Sigma公司）、Ⅳ型胶原（美国Sigma公司）、巢蛋白（美国RDSystems公司）、硫酸肝素蛋白聚糖重组蛋白（HSPG2，美国MyBioSource公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）；RPMI培养基（美国Thermofisher公司）、胎牛血清（美国Invitrogen公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）；倒置相差显微镜（OLYMPUSIX70）；YZ5F裂隙灯显微镜（苏州六六视觉科技股份有限公司）、Icare回弹式眼压计（美国Icare?tonometer公司）、眼底照相机（日本兴和公司）、OCT（德国海德堡公司）、ACCURUSCS玻切机（美国Alcon公司）；新西兰兔（中山大学中山眼科中心动物研究中心），RGC-5细胞系及荧光活性染色剂DIL由本课题组前期实验人员提供。
二、方法
1．生物活性黏合剂制备：
37℃环境下将8gNaCl、0.2gKCl、0.27gKH2PO4及2.68gNa2HPO4·7H2O加入ml蒸馏水充分混匀溶解，调溶液pH值至7.4后定容为1L的磷酸缓冲盐溶液保存于4℃冰箱；4℃环境下将2mg/ml层黏连蛋白、2mg/mlⅣ型胶原、0.1mg/ml巢蛋白及0.1mg/ml硫酸肝素蛋白聚糖重组蛋白溶于PBS混匀溶解，黏合剂按不同成分比例分为A组（60%∶30%∶10%∶10%）、B组（70%∶20%∶10%∶10%）、C组（50%∶40%∶10%∶10%），置于-80℃冰箱保存。
2．生物活性黏合剂黏性修饰视网膜神经支架：
4℃环境下，将A、B、C3个组黏合剂按照10、20、30及40μl/cm2的用量加入24孔板，将消毒后的视网膜神经支架（2mm×2mm，厚度60μm）经黏合剂黏附于孔板底面，室温下黏合3min后模拟细胞生长环境加入含90%RPMI及10%胎牛血清的细胞培养液1ml，置于37℃、5%CO2培养箱过夜，观察培养24h后支架黏附情况。24h后，支架黏附于孔板无脱落可认为"有效黏合"；支架漂浮，未黏合孔板可认为"无效黏合"。
3．生物活性黏合剂对细胞黏附性影响：
将初始浓度（C）为1×ml-1，体积（V）为μl的RGC-5分别接种在黏性修饰和无黏性修饰的支架材料上（n=30），培养24h后将支架移除，对孔板中残余细胞消化、离心，通过计数板计数孔板中残余细胞总数（R）计算细胞黏附率（%）：
4．生物黏合剂对细胞毒性影响：
培养24、48、96h后，分别对黏性修饰支架、无黏性修饰支架和无支架培养的细胞（n=30）使用CCK-8试剂盒及分光光度仪测定nm波长下的吸光度（A）值，其中E为支架培养细胞的A值，C为无支架条件下培养细胞的A值，B为空白组培养基的A值，计算细胞成活率（%）：
5．生物活性黏合剂联合支架内眼移植：
遵循中山大学中山眼科中心动物伦理及动物实验要求[动物合格证号：（粤）-]，对6只体重为3kg的新西兰兔按照随机数字表法随机选取单眼行黏性修饰支架移植术，对侧眼行单纯支架移植术。使用戊巴比妥钠（2ml/kg）联合速眠新（0.2ml/kg）对新西兰兔进行充分麻醉，术眼安尔碘消毒、开睑、建立睫状体平坦部3通道术口，23G玻璃体切除头（~0r/min）对兔眼后极部和周边部玻璃体切除，气液交换后，对视网膜表面滴注生物活性黏合剂0.1ml（30μl/cm2），将支架注入玻璃体腔，使用视网膜镊调整支架位置使其黏附于视网膜表层，检查支架黏合牢固后，使用C3F8气体充填玻璃体腔。术后1周内使用复方妥布霉素眼膏（美国Alcon公司）涂双眼2次/d。
6．生物活性黏合剂对眼组织相容性评估：
术后1周内每日上午10点对新西兰兔双眼行裂隙灯显微镜、眼底镜及眼压检查；术后3、5、7d对双眼行眼底照像及OCT检查，观察支架位置变化及术眼前房、玻璃体腔及视网膜组织反应。
三、统计学处理方法
采用SPSS16.0及GraphPadPrism6.0统计软件进行统计学分析，所有实验均重复3次。实验数据计量资料数据以均数±标准差表示，等级资料用数值变量表示。不同配比浓度生物活性黏合剂修饰神经支架的黏附效果比较采用卡方检验；采用Kolmogorov-Smirnov法对数据进行正态性检验，对不同支架材料的RGC-5细胞黏附率比较采用Mann-WhitneyU检验，对不同支架材料的RGC-5细胞成活率比较采用单因素方差分析，对移植术后不同组间兔眼眼压采用重复测量方差分析，P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、不同配比浓度生物活性黏合剂的黏附效果
使用A、B、C3个组生物活性黏合剂分别黏附96片支架，黏附24h后3个组支架有效黏合数量分别为72、55、53，有效黏合率分别为75.0%、57.3%和55.2%（表1），其差异具有统计学意义（χ2=9.69，P0.05）；其中，A组黏合剂用量为30μl/cm2时24h黏合率为91.7%，较其他用量黏合率高，其差异具有统计学意义（χ2=8.79，P0.05）；体外实验7d后黏合剂逐渐降解，支架底部局部脱离。根据支架24h有效黏合数量及黏合率综合评价黏合剂对神经支架的黏附修饰效果，结果显示层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖比例为60%∶30%∶10%∶10%的黏合剂在30μl/mm2时对神经支架的黏附修饰效果较好。
二、细胞在黏性修饰神经支架上的生长检测
培养24h后，黏性修饰支架的RGC-5细胞黏附率为86.85%，未修饰的细胞黏附率为13.78%，两者差异具有统计学意义（U=0.01，P0.05）；随着培养时间延长，两者支架细胞成活率均提高，细胞培养24、48、96h后黏性修饰的支架材料RGC-5细胞成活率分别为.18%±14.57%、.24%±13.23%、.31%±12.31%，未修饰者为.83%±12.31%、.45%±11.67%、.36%±13.24%，差异无统计学意义（F=7.，P=0.11），说明黏合剂及其降解产物未对细胞产生毒性；黏性修饰神经支架稳定黏附孔板，有利于细胞黏附于支架生长（图1）。
三、黏性修饰神经支架在内眼的黏附效果
支架内眼移植术后1周，6只兔眼中黏合修饰支架移植成功黏附5只眼，1只眼出现支架脱离，而无黏性修饰支架的6只眼支架均未黏附视网膜；移植术后黏性修饰支架移植的兔眼平均眼压为（18.4±0.9）mmHg（1mmHg=0.kPa），无黏性修饰支架移植的兔眼平均眼压为（17.1±1.0）mmHg，两组间差异无统计学意义（F=79.16，P=0.07）（图2）；眼底照相示黏性修饰支架移植后兔眼玻璃体腔及视网膜未见炎性反应（图3中A），OCT示黏合剂可将支架黏附于兔眼视网膜神经纤维层（图3中B）。
讨论
目前应用细胞治疗视网膜病变的研究包括对不同来源的干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞[15,16]、光感受器细胞[17]及RGC等[5]治疗年龄相关性黄斑变性[18]、视网膜色素变性[19]及视网膜神经细胞损伤[20]：Kamao等[21]将IPSC诱导为视网膜色素上皮细胞植片，并将1mm×2mm组织植片移植入恒河猴视网膜下腔；Shirai等[17]将人胚胎干细胞诱导为含有视锥及视杆等光感受器细胞成分的视网膜组织，并将其移植入光感受器细胞变性模型的恒河猴眼内。但视网膜神经纤维层及节细胞层的解剖位置、结构特性和功能复杂程度均决定了RGC细胞移植修复较视网膜色素上皮细胞、视锥及视杆细胞治疗更为困难。Venugopalan等[22]将6×个鼠源性RGC注入大鼠玻璃体腔，注射4周后70只眼中仅有6只眼出现了细胞整合。因此，RGC的损伤修复与视神经的功能重建是眼科学与脑科学领域亟待解决的重要问题，而应用干细胞诱导为特定视神经细胞并联合生物支架材料修复受损的RGC是解决该问题的一种方法，亦是眼科学与脑神经科学领域共同
