用于眼部给药的槲皮素与microRNA
摘要：目的制备槲皮素与microRNA-（mR）共载阳离子固体脂质纳米粒（Que/mRSLNs），考察其制备工艺，并评价其体外释放、细胞摄取能力以及眼部给药安全性。方法采用薄膜分散法制备包载槲皮素的阳离子固体脂质纳米粒（Que-SLNs），以平均粒径、多分散指数（PDI）、包封率为指标，优化其制备工艺；采用静电吸附法将mR共载于纳米粒中，制备Que/mRSLNs，通过琼脂糖凝胶电泳实验考察纳米粒对miRNA的吸附效率；并考察Que/mRSLNs中槲皮素的体外释药性能；采用MTT法测定Que/mRSLNs对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC增殖的影响，并对其进行荧光标记，观察其在HUVEC细胞中的摄取情况；并通过兔眼病理组织切片考察Que/mRSLNs对兔眼的刺激性。结果经过工艺优化，制得的阳离子纳米Que-SLNs载药性、粒径分布、稳定性均较好，其外观呈类球形，放置2个月能保持稳定，槲皮素包封率为（85.25±1.29）%，载药量（1.67±0.02）%，平均粒径（.00±2.10）nm，Zeta电位（53.20±5.12）mV；体外药物释放结果表明，槲皮素在纳米粒中释放较缓慢，48h内累积释放量约（80.69±1.29）%；在不同阳离子材料双十八烷基二甲基溴化铵与mR的质量比（DDAB/RNA）为6∶1时，阳离子固体脂质纳米粒可基本将mR包载完全，且对其粒径、电位影响较小；MTT实验表明，50～mg/L的空白纳米质量浓度对HUVEC细胞无明显增殖毒性；细胞摄取实验表明，Cy5与香豆素6（coumarin-6，C6）双荧光标记共载纳米能有效进入HUVEC细胞；兔眼病理组织切片显示Que/mRSLNs多次给药对眼部角膜组织无明显损伤。结论Que/mRSLNs固体脂质纳米粒制备工艺稳定可靠、重复性好、贮藏稳定性、生物安全性好，有利于高效递送槲皮素与mR进入HUVEC细胞，为年龄相关性黄斑变性等血管增生相关疾病的治疗提供思路。
眼底病是世界范围内致盲的重要原因，已经严重影响到人们的健康和生活质量。其中年龄相关性黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration，AMD）是一种渐进性眼底疾病，已成为全球中老年人不可逆失明的首要原因。AMD发病机制尚不完全清楚，目前研究表明，其与氧化应激、病理性新生血管化及慢性炎症反应密切相关，其中，视网膜（RPE）细胞氧化损伤和脉络膜新生血管化是其重要机制之一[1-4]。采用抗血管生长因子（VEGF）药物如Avastin、康柏西普等抑制脉络膜新生血管化，是AMD临床治疗的常用策略。但长时间使用抗血管生成药物可能会产生心脑血管并发症或抑制伤口愈合，需要筛选其他用于眼底病的有效药物。同时，由于眼部吸收障碍，临床上常使用玻璃体注射给药方式让药物蓄积在视网膜、脉络膜局部[5]，但这会给患者带来极大的不便，同时还有视网膜脱落、白内障和玻璃体出血等并发症风险[6]。故开发用于血管增生相关的眼底病，安全有效的治疗药物和给药方式具有重要意义。
槲皮素（quercetin，Que）是一种具有多种生物学活性的多羟基黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护、眼保护、抑制脉络膜血管新生[7-12]等药理作用。研究发现[13-15]，槲皮素能增强RPE细胞中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶、过氧化氢酶的活性，减少促炎因子IL-6、IL-8等的生成，抑制RPE细胞氧化应激损伤，从而治疗AMD。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码RNA，通过特异性抑制靶mRNA的翻译或降解来调节参与细胞增殖、凋亡、细胞周期进程和分化过程[16]。大量研究表明miRNAs的异常表达与AMD的发生与发展紧密相关，主要参与眼部病理性新生血管化、氧化应激以及免疫炎症反应等进程[17-19]。研究证明[20,21]，在眼部血管新生模型中，玻璃体注射microRNA-（mR）能显著下调CXCR4、DLL4、FZD4等血管生成靶基因的表达，从而抑制脉络膜血管新生。由于氧化损伤的RPE细胞功能障碍，会诱导炎性细胞分泌血管生成因子，促使血管通透性增加、血流量降低，诱导脉络膜新生血管形成，可引起视网膜组织的破坏，导致瘢痕形成，从而引起视力丧失[22-23]。因此，将槲皮素与mR联合应用，可发挥多靶点抗AMD作用，提高疗效。但是，由于槲皮素水溶性和脂溶性差，生物利用度低；miRNAs稳定性差，难以被细胞摄取等问题，极大地限制了它们在眼部给药的应用。
固体脂质纳米粒（solidlipidnanoparticles，SLNs）是近年来发展起来的新一代亚微粒给药系统，它是以固态天然脂质如卵磷脂或合成类脂如三酰甘油等为载体，将药物包裹或镶嵌于脂质或类脂核中，制备成的纳米给药系统[24-25]。在眼部给药中，纳米给药系统有助于提高药物渗透性、控制药物释放以及实现药物靶向转运[26]。由于眼角膜、结膜以及巩膜等组织带负电，因此，阳离子固体脂质纳米粒可增强其在角膜与巩膜的滞留时间，同时也能够增强药物在角膜与巩膜的透过性[27-29]。本实验将槲皮素与mR共同包载在阳离子SLNs中，实现了中药活性成分与基因药物的共递送，并希望通过局部滴眼给药的方式，将药物递送至眼后段发挥疗效，为AMD等血管增生相关疾病的治疗提供思路。
1仪器与材料
Agilent0高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；ResearchPlus移液器，德国Eppendorf公司；ZEN纳米粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；SYNERGYH1全功能酶标仪，美国BioTek公司；CPAB电子天平，赛多利斯天平有限公司；KMH1超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司；RE-B旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Ymnl-Y超声波细胞粉碎仪，南京以马内利仪器设备有限公司；JEM-EX透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；TCSSP8激光共聚焦显微镜，德国Leica公司；透析袋（截留相对分子质量），上海炎怡生物技术有限公司；CHA-S恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司；水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；S1移液管电动移液器，赛默飞世尔科技有限公司；kD超滤管，赛多利斯科学仪器有限公司。
槲皮素对照品，中国食品药品检定研究院，批号为81-，质量分数≥99%，槲皮素原料药，上海麦克林生化科技有限公司，批号为C，质量分数≥97%；大豆卵磷脂LipoidS（SPC），德国Lipoid公司；单硬脂酸甘油酯（GMS），上海源叶生物科技有限公司；双十八烷基二甲基溴化铵（DDAB），美国Sigma公司；胆固醇（Chol），美仑生物技术有限公司；Exgreen核酸染料，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；琼脂糖，BiowestAgarose公司；RNasefree水、mRmimics和Cy5-mR购于上海吉玛生物技术有限公司，其中mRmimics序列（5’-3’）为UCUCCCAACCC-UUGUACCAGUG；分析纯聚山梨酯80（Tween80）、甲醇、乙醇、氯仿均购于成都科隆化学品有限公司；色谱纯甲醇购于美国Sigma-Aldrich公司。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC由四川大学提供；新西兰大白兔，雄性，体质量2.0～2.5kg，由四川成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（川）-17。
2方法与结果
2.1载槲皮素阳离子固体脂质纳米粒（Que-SLNs）的制备与表征
2.1.1Que-SLNs的制备称取适量槲皮素，取一定量SPC、GMS、Chol、DDAB作为混合脂质材料，共同溶于适量氯仿与乙醇混合溶剂中，加入茄形瓶中，在45℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂，得到一层脂质薄膜，加入一定量RNasefree水，37℃下水化脂质薄膜，水化混悬液用细胞破碎仪进行超声分散，过0.45μm微孔滤膜，即得到Que-SLNs。
同法不加槲皮素以制备空白SLNs。
2.1.2包封率及载药量的测定采用高速离心法结合HPLC法，测定Que-SLNs中槲皮素含量，并计算其包封率及载药量[30]。
包封率＝Wa/Wb
载药量＝Wa/Ww
Wa表示纳米粒载体中槲皮素的质量，Wb表示槲皮素投药量，Ww表示纳米粒中槲皮素的质量加上载体材料的质量
2.1.3粒径及Zeta电位的测定利用ZEN系列纳米激光粒度仪测定纳米粒的粒径分布及Zeta电位。取0.1mL固体脂质纳米粒混悬液稀释至1mL，设置纳米粒度仪温度为25℃，平衡时间为2min，每个样品重复测定3次。
2.2槲皮素HPLC含量测定方法的建立
2.2.1色谱条件色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18柱（mm×4.6mm，5μm）；以甲醇-0.2%磷酸水溶液（60∶40）为流动相；检测波长为nm；柱温为35℃；进样量10μL；体积流量为0.8mL/min；理论塔板数按槲皮素峰计算不低于。
2.2.2对照品溶液的配制精密称定槲皮素对照品适量置于mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为99.60mg/L的槲皮素对照品溶液作为对照品储备液。
2.2.3供试品溶液的配制精密量取Que-SLNs溶液1mL至25mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.2.4线性关系考察分别精密量取槲皮素对照品溶液适量置于25mL量瓶中，配制成1.99、3.98、7.96、11.94、15.92、23.88mg/L的系列质量浓度对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积。以槲皮素质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为A＝29.C－6.，r2＝0.，结果表明槲皮素在1.99～23.88mg/L具有良好的线性关系。
2.2.5方法学考察分别吸取槲皮素对照品溶液、Que-SLNs、空白SLNs各10μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果如图1所示，空白SLNs在槲皮素出峰处（约8.5min）无干扰，说明本方法专属性良好。
分别取1.99、7.96、23.88mg/L的槲皮素对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别于1d内测定6次，连续测定3d，记录峰面积，计算日内、日间精密度均小于2%，说明仪器精密度良好。
分别取同一批次的Que-SLNs供试品6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定峰面积，计算得槲皮素质量浓度的RSD值为0.82%，表明该方法重复性良好。
精密吸取槲皮素供试品溶液于制备后0、2、4、6、8、12、24h下，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定峰面积，结果24h内供试品溶液中槲皮素峰面积的RSD值为1.04%，表明供试品溶液在24h内稳定。
精密吸取1mL空白固体脂质纳米粒溶液9份，分成3组，置于10mL量瓶中，每组分别精密加入1mL的低、中、高质量浓度（1.99、7.96、23.88mg/L）的槲皮素对照品溶液，用甲醇定容至刻度，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定槲皮素的含量，计算回收率。结果表明，低、中、高3个质量浓度的平均回收率分别为.72%、.32%、97.34%，RSD值分别为1.36%、0.71%、0.80%，表明该方法准确度良好。
2.3Que-SLNs制备工艺考察及优化
2.3.1槲皮素投药量的考察分别取0.5、1.0、1.5mg槲皮素，按照上述处方和工艺，制备Que-SLNs，考察不同槲皮素投药量对所制得纳米粒的粒径、多分散指数（PDI）以及包封率的影响。结果如表1所示，随着投药量增加，包载效果逐渐降低，平均粒径和PDI逐渐增大，故选用0.5mg槲皮素作为处方投药量。
2.3.2有机溶剂比例的考察取0.5mg槲皮素与上述处方中脂质材料，溶于不同比例的氯仿与无水乙醇混合溶剂（1∶1、2∶1、5∶1）中，按照上述工艺制备Que-SLNs。结果如表2所示，当氯仿比例增加时槲皮素的包封率增加，但对粒径影响不大，故选择氯仿-无水乙醇为5∶1混合溶剂作为油相。
2.3.3GMS/SPC比例的考察取0.5mg槲皮素与不同比例GMS/SPC（2∶1、1∶1、1∶2、1∶4），溶于混合溶剂中，按照上述工艺制备Que-SLNs。结果如表3所示，在增加SPC的比例时，Que-SLNs粒径在GMS/SPC比例为1∶2时有最小值，包封率在GMS/SPC比例为1∶2时有最大值，故确定GMS/SPC比例为1∶2，磷脂在体系中作为辅助脂质和乳化剂，在比例较小时随着它的增加，可以增加药物的包封率。但继续增加其比例时，包封率反而下降，且粒径也有所增加，可能原因是，较大比例的磷脂在体系中有大量生成脂质体的倾向，反而不利于药物和脂质之间的亲和力。
2.3.4DDAB用量的考察DDAB是阳离子SLNs的重要组成，对miRNAs包载性能影响较大，故对SLNs中DDAB用量进行考察。取0.5mg槲皮素与上述处方中脂质材料，改变不同DDAB的用量（0、5、10mg）溶于氯仿与无水乙醇混合溶剂中，按照上述工艺制备Que-SLNs。结果如表4所示，随着DDAB增加，槲皮素的包封率增加，但平均粒径逐渐增大，可能的原因是DDAB作为一种W/O型乳化剂，在制备的过程中有利于槲皮素与脂质之间充分接触，从而提高包封率；同时DDAB又作为一类季铵盐类阳离子脂质，随着它的量增加，潜在的细胞毒性也会增加。故确定为DDAB投入量为5mg制备Que-SLNs。
2.3.5超声时间与功率的考察取0.5mg槲皮素与上述处方中脂质材料，溶于氯仿与无水乙醇混合溶剂中，改变不同的探超条件，按照上述工艺制备Que-SLNs。结果如表5所示，随着超声功率以及超声时间的增加，纳米粒的粒径有所下降，而对包封率的影响并不是很大。但考虑的制备Que-SLNs溶液体积较小，长时间使用较大功率会对仪器造成损坏，而选择比较温和的超声功率，增加它的超声时间同样也能制备粒径较小，包封率较高的槲皮素固体脂质纳米粒。综上，选择超声功率为W，超声时间为6min的条件即可。
2.4Que-SLNs制备工艺和处方的确定
根据上述单因素考察结果，优选Que-SLNs处方和制备工艺如下：称取GMS5mg，SPC10mg，胆固醇5mg，DDAB5mg和一定量槲皮素，5mL三氯甲烷-无水乙醇（5∶1）的混合溶剂溶解，并充分反应，然后减压旋蒸除去有机溶剂形成一层均匀的薄膜，接着用RNasefree水水化薄膜，接着用超声功率为40%探头超声6min，过0.45μm微孔滤膜，即得Que-SLNs，制备3批样品，测得其包封率为（85.25±1.29）%，载药量为（1.67±0.02）%，粒径为（.00±2.10）nm，PDI为0.30±0.01，Zeta电位为（53.20±5.12）mV（n＝3）。Que-SLNs的粒径分布、Zeta电位和外观见图2。
2.5不同纳米复合物的制备
取50μLQue-SLNs溶液，逐滴加入等体积的miRNAs溶液，在室温下轻轻振摇30min，即得Que/mRSLNs复合物溶液。并控制体积不变，稀释纳米粒至不同质量浓度，以改变不同阳离子材料DDAB与mR的质量比（DDAB/RNA），分别制备不同的Que/mRSLNs复合物。
2.6不同纳米复合物的表征
2.6.1不同纳米复合中miRNAs包载性能考察将不同DDAB/RNA的Que/mRSLNs复合物稀释至1mL，于ZEN纳米粒度仪下测其粒径和Zeta电位，设置温度为25℃，平衡时间2min，结果见图3。
结果表明，空白Que-SLNs的平均粒径为（.27±2.15）nm，PDI为0.28±0.01；负载mR后，在DDAB/RNA比例为6∶1时，Que/mRSLNs的平均粒径为（.87±0.74）nm，PDI为0.13±0.03。在DDAB/RNA比例为4∶1时呈现负电荷，因为低质量浓度的DDAB-Que-SLNs不足以缩合大量的miRNAs。
2.6.2琼脂糖凝胶电泳实验[31-32]称取0.3g琼脂糖溶于30mLTAE缓冲液，微波炉加热溶液，沸腾2次至完全溶解，配制成1%琼脂糖胶液，加入5μLExGreen摇匀，倒入制胶玻璃槽内，插入梳子，30min待胶冷却后，放入电泳池中。分别取10μL不同DDAB/RNA比值样品与5μL上样缓冲液混合，每孔上样10μL，在TAE缓冲液中，V恒压电泳15min，凝胶成像系统观察并拍照，结果见图4。结果表明，裸miRNAs在孔中无滞留，游离条带很亮；在DDAB/RNA为4∶1时，有一部分留着孔内，有一部分游离条带，表示miRNAs未被压缩完全。另一方面，在DDAB/RNA比值为6∶1时，游离的miRNAs几乎没有，而全部滞留在孔中，表明miRNAs几乎全部压缩在固体脂质纳米粒中，这与在不同纳米复合中miRNAs包载性能考察所得结论相吻合，进一步说明最优的DDAB/RNA为6∶1，所以后续实验采用DDAB/RNA为6∶1来确定mR和Que-SLNs的加入量。
2.6.3Que/mRSLNs形态学观察将所制备的空白SLNs和Que-SLNs，DDAB/RNA为6∶1的Que/mRSLNs用纯水稀释至适宜浓度滴至铜网上，用2%磷钨酸染色后自然晾干，用透射电镜观察其形态，并拍摄照片，结果见图5。结果表明SLNs与Que-SLNs形态比较规则圆整，大小相差不大，粒径在nm左右，载mR纳米粒比Que-SLNs稍大，粒径在nm左右，这与动态光散射法所测得结果相一致。
2.6.4Que-SLNs初步稳定性考察按照已确定处方，制备3批Que-SLNs，避光保存在4℃条件下，在2个月内测定其粒径与Zeta电位，结果见表6。结果显示Que-SLNs在2个月内稳定。
2.7Que-SLNs的体外释放
本实验采用透析法进行体外释药研究，设定空气浴摇床温度为37℃，振荡频率为恒速r/min。每组设置3个平行样，取Que-SLNs胶体溶液2mL置透析袋中，排出气泡，并将两端扎紧，置50mL含有1%聚山梨酯80生理盐水溶液中，在预定时间点（0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h）取样1mL，同时补加1mL相同温度的释放介质。将所取样品在r/min条件下离心15min，取10μL样品按“2.1.1”项下色谱条件下进样分析，计算累积释放率（Qn）。同法以相同质量浓度槲皮素原料药的丙二醇溶液作为对照进行体外释放试验。结果见图6。由图可知，游离槲皮素在4h时基本已释放完全。而Que-SLNs溶液释放前期较快，后期较慢，48h内释放量达（80.69±1.29）%，总体呈现明显的缓释作用。经拟合累计释放率符合一级动力学方程，拟合方程为ln(1－Qn)＝?0.t－0.，r2＝0.。
2.8Que-SLNs的细胞毒性考察
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC培养于37℃、5%CO2条件下，取生长状态良好的HUVEC细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化反应，并吹打均匀。在血球计算板上计数，调整细胞悬液浓度，种板于96孔板中（每孔个），在培养箱中继续培养24h待细胞贴壁后，弃去培养基，换上含有不同质量浓度梯度药物的新鲜培养基（药物含空白纳米浓度梯度分别为50、75、、、mg/L），与细胞孵育4h后，更换新鲜含有10%胎牛血清完全培养基继续培养48h，每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液继续孵育4h后，弃去原有培养基，每孔加入μLDMSO溶液，与摇床上低速振荡15min，然后在nm处，用酶联免疫检测仪以nm波长测定吸光度（A）值。每组设置4个复孔，以不加药的无血清培养基的细胞孔为对照，并设不加细胞孔为调零对照，计算细胞存活率。按公式细胞存活率＝(A给药－A调零)/(A空白－A调零)计算细胞存活率，结果见图7。结果表明，SLNs和Que-SLNs纳米溶液在纳米材料质量浓度为50～mg/L时对HUVEC细胞存活均没有明显影响，但mg/LSLNs与细胞共孵育后，细胞存活率下降为78.84%。为避免高浓度聚合物材料对细胞存活造成降低，故选择50～mg/L的纳米材料质量浓度进行后续的细胞摄取实验。
2.9HUVEC的细胞摄取实验
2.9.1双荧光标记Que/mRSLNs的制备用香豆素-6（coumarin-6）代替槲皮素，cy5标记的mR代替mR，按照“2.5”项下方法制备双荧光标记的Que/mRSLNs（C6-SLNs/cy5-mR）。
2.9.2双荧光标记C6-SLNs/cy5-mR的细胞摄取实验取对数生长期HUVEC细胞，种1×个HUVEC细胞铺在激光共聚焦专用玻底皿，贴壁过夜后，每皿给μL双荧光标记固体脂质纳米粒（含0.5μgcy5标记的mR，0.17μgCoumarin-6）4h后，弃去药液，用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定约10min后，继续用PBS洗涤2次后，加入DAPI染液孵育5min后，加入两滴抗荧光衰减液，在激光共聚焦下观察细胞摄取药物情况。结果如图8，DAPI标记的细胞核带蓝色荧光，Coumarin-6与mR（cy5）被摄取进胞质分别带绿色荧光和红色荧光，说明载药SLNs已进入胞质中，但其入胞机制有待进一步研究。
2.10Que/mRSLNs的眼部刺激考察
2.10.1Que/mRSLNs的眼部刺激考察选取健康新西兰大白兔5只，分别给予健康家兔左眼滴生理盐水50μL，右眼滴注50μLQue/mRSLNs，分别记录单次给药后2、6、12、24、72、、h兔眼的局部反应情况。按照Draize[33-34]眼部刺激试验评分标准进行眼刺激性评价。结果显示，Que/mRSLNs组多数在第1次给药见结膜有少量分泌物，平均评分为0.80±0.45，其余时间点均为0分，均在0～3分的无刺激性范围。
2.10.2角膜组织学观测给药的第7天分离出角膜组织，在10%福尔马林溶液中固定，再用梯度酒精溶液脱水，在二甲苯溶液中清洗，再用石蜡固定。对石蜡进行切片，厚度为3μm，用苏木精-伊红染色，显微镜观察角膜及视网膜组织学改变，结果见图9。由图9可知，NS和Que/mRSLNs组的角膜上皮细胞都较为完整，细胞排列紧密，基质层纤维排列规则，均未见炎性细胞。结果表明Que/mRSLNs对家兔角膜上皮细胞无明显损伤，较为安全。
3讨论
SLNs的制备方法主要有高压乳匀法[35]、乳化蒸发-低温固化法[36-38]、薄膜-超声法[39]、熔融超声法[40]、微乳法[41]等，但是乳化蒸发-低温固化法等方法在制备的过程中需要加热温度比较高，可能使槲皮素发生降解。而薄膜-超声法条件温和，制备工艺简单稳定可靠，重复性好，适用于不稳定药物SLNs的制备。因此，本实验选用薄膜-超声法制备阳离子Que-SLNs，并利用Que-SLNs表面所带的正电荷吸附mR，构建联合包载mR与槲皮素的Que/mRSLNs。
在实验中，Que/mRSLNs复合物的粒径随着DDAB/RNA比例增加而减小，值得注意的是Que/mRSLNs复合物溶液的PDI值远远小于空白Que-SLNs溶液的PDI值，且在DDAB/RNA比例为6∶1时最小。可能原因是，没有加mR的槲皮素固体脂质纳米粒表面较粗糙，粒子粒径分布不均一，而与mR复合后，Que-SLNs溶液被一定程度的稀释，等体积mR能有效的缩合在固体脂质纳米粒的表面，使粒子分布更加规则、均一。在DDAB/RNA比例为4∶1时呈现负电荷，因为低质量浓度的DDAB-Que-SLNs不足以缩合大量的mR。随着DDAB-Que-SLNs的量逐渐增加时，Que/mRSLNs复合物的Zeta电位也在逐渐增加。Zeta电位增加的趋势逐渐趋于平缓，说明mR有逐渐被完全缩合的趋势。
在琼脂凝胶电泳试验中，在DDAB/RNA质量比大于6∶1时，胶孔中mR滞留量比6∶1时要少，可能是高浓度的聚合物材料在mR凝胶电泳过程中，造成了包裹和干扰，所以当DDAB/RNA质量比达到12∶1，甚至16∶1时，miRNA条带变得弥散，且亮度减弱。同时，Que/mRSLNs复合物在DDAB/RNA比例为4∶1时未将mR缩合完全，所以有游离条带，在比例为6∶1时起便无游离条带，说明可在较低的DDAB/RNA下可完成对mR的包载，这也验证了之前的结论。在制剂处方筛选中，虽然根据药物的理化性质筛选了较优处方和比例，但未从药效的角度调整槲皮素与mR的剂量。在接下的研究中，本课题组将进行药效学研究。同时，还将对阳离子固体脂质纳米粒增加相关配体，进一步优化制剂处方比例以获得更好的疗效。
参考文献（略）
来源：陈梁，李维，唐琦，王迪，邱海燕，陈加容，章津铭，邹亮．用于眼部给药的槲皮素与microRNA-共载阳离子固体脂质纳米粒制备及初步评价[J].中草药,,51(18):-.
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