X连锁视网膜劈裂患者的3D视网膜类器官模
专业治白癜风医院 http://baidianfeng.39.net/a_zhiliao/160122/4763417.htmlX连锁青少年视网膜劈裂(X-linkedjuvenileretinoschisis，XLRS)是一种较常见的早发型中央视网膜退行性疾病，以独特的视网膜劈裂表型命名，全世界发病率为1/~1/。XLRS的临床特征包括轻度到重度和渐进性的中央视力丧失、中心凹劈裂引起的放射状条纹、周围视网膜层间的劈裂、视网膜脱离和玻璃体出血。RS1为XLRS的致病基因，编码一种高度保守分泌的胞外蛋白。RS1蛋白是通过内质网（ER）途径介导蛋白分泌的。RS1蛋白主要分布在视网膜视杆和视锥细胞内节部分的胞外表面，以及双极细胞和两层丛状细胞层内。虽然小鼠模型可以作为研究视网膜疾病机制的有效工具，但小鼠和人类的视网膜存在差异。例如，在小鼠(一种夜行性动物)和人类中心凹之间，视杆与视锥细胞的比例存在显著差异。人类诱导多能干细胞(Humaninducedpluripotentstemcells，hiPSCs)已成为一种有潜力的替代动物疾病的建模系统。hiPSCs可以从患者中产生并分化成与疾病建模相关的特定细胞和组织类型。此外，hiPSCs还能在患者特定的遗传背景下发现并验证基因型与表型之间的功能关系。最近的几项研究利用hiPSCs来研究人类遗传性视网膜病变。然而，到目前为止，hiPSCs起源的视网膜细胞还没有被用来研究XLRS的分子和细胞机制。因此在本研究中，研究者纳入了RS1突变的XLRS患者来诱导生成患者特异性的hiPSCs，并进一步诱导分化成3D视网膜类器官模型来研究XLRS。相关研究文章“MorphologicalandMolecularDefectsinHumanThree-DimensionalRetinalOrganoidModelofX-LinkedJuvenileRetinoschisis”发表在StemCellReports杂志上。图.人3D视网膜类器官系统疾病建模原理图XLRS患者特异性hiPSC的构建，获得3D视网膜类器官作为体外模型纳入两个XLRS患者（Pt-1和Pt-2）和两个正常对照（Ctrl-1和Ctrl-2）。两个患者均表现出异常的视网膜劈裂和轮辐状样的黄斑萎缩（图1A）。两个患者各携带RS1突变c.CT(p.RC)和c.GA(p.WX)。采集患者和正常对照外周血的单核细胞，利用非病毒的质粒来进行细胞的重编程获得hiPSCs。对患者来源的hiPSC克隆进行测序确定了c.CT和c.GA的RS1突变（图1B）。继续利用hiPSCs诱导分化成3D视网膜类器官（图1C）。第20天时，分离并悬浮培养密集的神经玫瑰花结，在第30天形成3D视杯(retinalcups，RCs)（图1D）。从第90天到第天，光感受器特异性蛋白RCVRN(Recoverin)的表达持续增加(图1E)。相比之下，正常对照的RCs中RS1表达随时间增加而增加，但其在Pt-1的RCs中的整体表达减少，而在Pt-2的RCs中几乎没有表达(图1E)。此外，从第天开始，两个患者的RCs中都出现了明显的视网膜劈裂表型，但在对照RCs中没有出现(图1F)。患者RCs中RS1蛋白的免疫荧光染色证实了RS1蛋白位于发育中视网膜外层的位置，而且从第天开始，与对照RCs相比患者的RS1蛋白的表达明显下降(图1G)。第天时，对患者和正常对照各个RCs进行评估，发现至少有80%的突变型RCs具有囊腔/劈裂样特征，而少于20%的正常对照RCs具有该表型。数量具有明显的统计学差异（图1H-I）。且与对照RCs相比，患者来源的RCs的截面平均劈裂面积更大（图1J和1K）。以上结果表明，RS1蛋白的表达与RC结构的完整性相关，尤其是与ONL和INL之间的连接，反映了hiPSC分化的3D视网膜类器官是研究视网膜劈裂合适的体外模型。图1.XLRS患者特异性hiPSCs分化3D视网膜类器官RS1突变导致RS1蛋白分泌和神经视网膜外节发育缺陷RS1是一种分泌蛋白，它形成一种二硫化物连接的同八聚体。为了检测RS1突变是否影响其同源八聚体复合物的形成，构建了野生型和CT突变型的RS1质粒转染到HEK细胞中并分离出裂解物，发现野生型RS1的大小约为kDa，与RS1八聚体的预期大小一致（图2A）。而CT突变型RS1，尽管单体表达稳定，但未能产生成熟的复合物，也不能分泌（图2A）。第天时患者的RCs同样未能产生成熟的RS1八聚体，并且RS1蛋白的表达在Pt-1RCs中显著降低，在Pt-2RCs中几乎不存在（图2B）。RS1在分泌前，需要通过ER和高尔基体成熟。为了检测突变RS1分泌的问题所在，对RS1过表达的HEK细胞和天的RC进行ER标记物GRP94或高尔基标记物Golgi97的免疫共染色。在HEK细胞中，野生型RS1与GRP94和Golgi97明显共定位，而CT突变型RS1仅与GRP94有共定位，与Golgi97几乎没有重叠（图2C-2E）。而在天的患者RCs中，RS1与GRP94的共定位表达尽管减少了，但仍然很容易被检测到，而几乎没有突变蛋白与高尔基标记物共定位（图2F-2H）。以上结果证实了RS1分泌缺陷可能是由于蛋白质的不完全加工和运输造成的。患者RCs中的视紫红质和G/R视蛋白免疫荧光显示更少的感光细胞(图2I和2J)。视锥细胞(G/R视蛋白)数量比视杆细胞(视紫红质)数量减少更严重(图2K)。相比之下，尽管RS1表达持续严重下降(图2J-2L)，但患者RCs内节部分(COXIV)和双极细胞(PKCa)的表达没有受到影响(图2I、2L和2M)。这些结果证实了RS1突变与外层缺陷之间的相关性，导致了3D类器官中蛋白分泌过程和光感受器细胞发育的缺陷。图2.RS1突变的3DRCs的劈裂表型和缺陷的光感受器细胞RS1突变影响了神经元的粘附能力和外节的成熟E-Cadherin是一种在神经视网膜中表达的同型细胞-细胞黏附介质，RS1在感受器细胞和双极细胞上与Na/K-ATPase跨膜信号体复合物的相互作用可能通过Paxillin连接，而Paxillin是一种对细胞-基质相互作用至关重要的局部性黏附蛋白。对天的RCs染色发现虽然E-Cadherin和Paxillin蛋白的表达水平和分布不受影响，但在患者的RCs中，视网膜组织的结构紊乱，存在许多大的细胞间隙（图3A）。用延时全反射荧光显微镜测量paxillin从RCs细胞中分离组装和拆卸次数(图3B)，观察到速度加快的现象(图3B和3C)，导致在患者来源的细胞中有更快的局部粘附周转率（图3D）。因此，paxillin的快速循环可能导致了XLRS中的结构缺陷和光信号传导减弱。连接纤毛是光感受器细胞成熟和胞内运输的关键结构。因此外节发育的缺陷促使研究者研究RS1突变RCs中连接纤毛的结构。在天RCVRN阳性的RCs中对纤毛标记物ARL13B和谷氨酰胺化小管蛋白(GT)进行了染色。与对照RCs相比，患者来源的RC中ARL13B和GT信号均显著降低(图3E-3G)，这表明RS1突变的光感受器细胞存在连接纤毛和外节结构缺陷。与正常RCs相比，在患者的RCs中，视杆细胞(视紫红质)较少，只有很少的G/R视蛋白，几乎没有蓝视锥细胞（图3H）。此外，患者RCs中的视杆细胞经常是畸形异常的（图3I）。通过透射电镜（TEM）观察到正常对照的RC光感受器细胞在天时表现出正常的形态特征(图3J)。相比之下，患者的RC光感受器细胞常常缺乏明显的外节部分，并含有大的囊泡和基底部，且位置异常（图3J）。总之，以上数据显示了患者RCs中异常的形态和不成熟的外节部分，视杆细胞和视锥细胞数量减少，并加快了局部的粘连。图3.XLRS视网膜类器官中纤毛形成紊乱和黏附丧失在患者特异性hiPSCs中进行高效的CRISPR/Cas9介导的基因矫正研究者探究CT突变是否可以使用最近开发的Cas9导向的基因编辑方法进行修复。设计了向导RNA(gRNA)靶序列和同源修复模板，将突变的Cys密码子转化为Arg密码子，从而恢复野生型RS1氨基酸序列(图4A)。并设计了两种矫正CT突变的方法（图4B）。两种方法都有很高的修复成功率。从方法1(R1)和方法2(R2)中选择两个成功矫正的克隆（图4C）。且没有脱靶的现象。CRISPR/Cas9介导的RS1基因矫正恢复了患者视网膜类器官的病理表型、RS1蛋白的分泌和视网膜外节部分的粘附能力将R1和R2的hiPSC克隆分化为3D视网膜类器官。修复后的克隆在分化过程中和天时无突变RCs中所见的疾病特异性的劈裂表型(图4D，4E和4F)。两种矫正方法生成的RCs都能够产生-kDa的RS1同八聚体（图4G和4H）。与未矫正的RCs相比，矫正的RCs(R1和R2)在天时，RS1与ER和高尔基体的共定位增强了(图4I-4K)。这些数据表明修复突变的RS1基因可以恢复正常的细胞内转运、聚合和RS1蛋白的分泌。矫正的RCs在第天时感光细胞数量和正常的外节结构均增加。相反，患者RCs的感光细胞较少，外节结构异常（4L-4N）。矫正的RCs免疫染色显示纤毛表达增加(图5A-5C)，E-cadherin和paxillin染色也显示视网膜组织结构更厚、更规则、更完整(图5D)。此外，与CT突变RCs相比，在矫正的RCs中paxillin在分离的视网膜细胞中更稳定（图5E-5G）。TEM显示矫正后的RCs有合适的外节部分和感觉纤毛形成（图5H）。综上所述，CRISPR介导的RS1基因矫正恢复了细胞劈裂的表型，增加了纤毛标记物的表达，稳定了paxillin，恢复了外节部分结构的形成和RS1的分泌（图5I）。图4.CRISPR/Cas9介导的RS1突变hiPSCs基因矫正的设计图5.CRISPR/Cas9矫正的视网膜类器官恢复纤毛形成和细胞粘附在正常对照iPSCs中利用CRISPR/Cas9定向构建RS1点突变导致分化的视网膜类器官出现劈裂表型为了进一步确定视网膜劈裂表型确实是由RS1突变引起的，研究者使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在正常人的hiPSCs系中产生了两个RS1突变的克隆(RS1-M1和RS1-M2)。设计了一个单一的gRNA靶序列和一个同源模板，用于将Ctrl-1的hiPSCs中的野生型Arg密码子转化为Cys密码子，从而产生一个突变的RS1氨基酸序列(RS1-M1和RS1-M2;图6A和6B)。在分化的第天，与对照RCs相比，CRISPR诱导的突变RCs中有较大的劈裂区域(图6C和6D)。RS1与GRP94和Golgi97的共定位表达降低(图6E–6G)，RS1表达降低(图6E)。此外，表达视紫红质和G/R视蛋白的细胞数量减少(图6H-6J)。且形成同源八聚体复合物的能力丧失（图6K）。因此以上结果能够确定RS1基因突变与细胞表型的关系。图6.利用CRISPR/Cas9插入CT突变的RCs的特征RNA测序显示患者的视网膜类器官中另外两种眼病基因IQBT1和OPA1的表达降低为了进一步了解XLRS的分子缺陷，对正常对照RCs、患者RCs(Pt-1,c.CG)、R1-RCs和R2-RCs在不同时间点(0-天)提取的总RNA进行了深度测序。发现正常对照RCs和CT-RCs在分化过程的不同时间上均有明显的差异，分化时间越长差异越明显（图7A）。而矫正后的RCs转录组与正常对照RCs高度相似，与患者RCs有显著差异（图7B）。由于RS1只在分化后期表达，因此重点分析了诱导后90、和天在患者RCs中表达均减少至少2倍的基因（图7C）。发现在正常RCs中有个基因过表达(图7D，左)。根据基因富集分析(GSEA)注释，这个基因中有9个与眼睛发育有关(图7D，右)。在这9个基因中，RS1、IQCB1和OPA1的表达在CRISPR矫正的RCs中表达恢复(图7E)。而在视网膜分化的后期，他们的相对表达的降低变得更加明显(图7F)。其中IQCB1与Leber先天性黑朦有关，OPA1与常染色体显性遗传的视神经萎缩有关。以上转录组分析结果反映了RS1突变的RCs中的疾病表型，并揭示了XLRS与其他遗传性视网膜病变的潜在联系。图7.RNA测序揭示了RS1相关的基因表达变化综上所述，XLRS患者特异性hiPSC来源的3D视网膜类器官可以作为一个有效的模型来研究视网膜病变的病理生理机制，并可用于开发和优化治疗方法，包括体内的基因治疗。参考文献：MorphologicalandMolecularDefectsinHumanThree-DimensionalRetinalOrganoidModelofX-LinkedJuvenileRetinoschisis.StemCellReports.Nov12;13(5):-.点评先天性视网膜劈裂症（XLRS）是一种X连锁隐性遗传视网膜变性，全球有数十万人因此病已经失明或者正在丧失视力。劈裂病变累及双侧视网膜，造成视网膜神经纤维层和视网膜神经节细胞层之间劈裂。文献报道该病在男性中的患病率为1:~1:2，我国目前尚无确切患病率，初步估计我国至少有10万人患病。XLRS的致病基因RS1于年克隆，RS1蛋白是一个高度保守的细胞外分泌型可溶性寡聚蛋白，在视锥、视杆细胞内节细胞外表面、双极细胞以及松果体有表达。与细胞-细胞间相关作用及细胞黏附有关。RS1蛋白能够维护视网膜细胞层间结构，保证突触连接正常及促进视觉信号的转导，并且对视网膜的发育有重要作用。基因治疗是目前XLRS最具有前景的治疗手段，美国迄今开展了两项XLRS基因治疗临床试验，初步结果显示玻璃体腔注射腺相关病毒（AAV）载体安全性良好，有短期效果；但部分受试者炎症反应明显，治疗效果不显著且仅短时间发挥效果，没有达到科学家预期结果；其中一项临床试验已提前终止，究其原因在于所用载体的免疫原性高及视网膜转染率欠佳所致。鉴于目前XLRS研究面临的种种困难，从XLRS患者获得的iPSC突破了人体视网膜组织难以取材的限制，可产生大量携带致病基因突变的细胞，能更好的在体外重现疾病的发病过程和病理形态，在疾病模型建立与机理研究、细胞治疗、药物发现与评价等方面具有非常大的应用价值。医院邹绚总主编：陈有信副总主编：赵潺轮值主编：邹绚编委：李东辉，张夏，陈迪，李文硕，韩若安，贺峰，卞爱玲，张燕宁，陈哲，孙璐，谢海燕，曹淼，翁再虹，王新瑞编辑：王新瑞预览时标签不可点
